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    Elisa试剂盒的三种常见检测办法

    发布时间: 2020-07-13  点击次数: 104次
       ELISA测定形式包括以下几种:双抗体夹心法、间接法、双抗原夹心法、IgM抗体捕捉法、竞赛抑制法,其间竞赛抑制法(HBeAb,HBcAb等选用)因受操作时差所引起的不公平竞赛等因素的影响,成果重复性较差,质量较难操控。不同批次的ELISA试剂在制作过程中很难确保质量完全一致,即使是通过批批检的项目其检测成果也存在差异,因此有必要挑选和订购长批号的试剂,并确保保存条件。
      严格执行这一规范能够防止因试剂批号改变而从头树立质控体系及从头评估试剂的复杂过程,而且能够确保成果的稳定性;对于效期短、使用率低的试剂,应当小量分装,每次使用则取分装部分即可,防止重复冻融形成试剂的失效。下面就依据Elisa试剂盒的三种常见检测办法剖析?下具体原理。欢迎参阅学习。
      问:什么是竞赛性ELISA?
      答:竞赛ELISA基于竞赛结合技能,即样本中的待测分子与固定量的符号的相同分子(我们一般用碱性磷酸酶作为符号)同时与固定在孔板上的抗体的同一结合位点进行竞赛,参照规范曲线,实验数据值是定量的。
      问:什么是夹心ELISA?
      答:夹层ELISA选用对样本中剖析物的特异的抗体作为固定化的捕获抗体,然后用第二个带符号的抗体作检测,检测抗体对剖析物也是专注的。当参照规范曲线时,实验数据值是定量的。
      问:什么是直接ELISA?
      答:直接ELISA是将被测的剖析物直接包膜在微孔板外表,然后用测验抗体来证明被测剖析物的存在。当与重组蛋白(规范曲线)进行参照时,实验数据值是半定量的。
      Elisa试剂盒的注意事项:
      正式试验时,应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件,待检样品应作一式二份,以保证实验结果的准确性。有时本底较高,说明有非特异性反应,可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。
      实验条件的选择
      在ELISA中,进行各项实验条件的选择是很重要的,其中包括:
      (1) 固相载体的选择:许多物质可作为固相载体,如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体,在使用前均可进行筛选:用等量抗原包被,在同一实验条件下进行反应,观察其显色反应是否均一性,据此判明其吸附性能是否良好。
      (2) 包被抗体(或抗原)的选择:将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时,要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0~9.6之间。吸附温度,时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃ 18~24小时。蛋白质包被的适浓度需进行滴定:即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg/ml等)进行包被后,在其它试验条件相同时,观察阳性标本的OD值。选择OD值大而蛋白量少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1~10μg/ml。
      (3) 酶标记抗体工作浓度的选择:首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记抗体部份)。然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。
      (4) 酶的底物及供氢体的选择:对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应,而本身无色。有些供氢体(如OPD等)有潜在的致癌作用,应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体,如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后,应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间,以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制,尤其是H2O2在临用前加入。
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